Leonardo insan anatomisi konusundaki çalışmalarına Andrea del Verrocchio'nun yanında çıraklık yaparken başladı, çünkü Verrochio tüm öğrencilerini anatomi öğrenmeleri konusunda teşvik ederdi. Sanat alanında başarı kazanmaya başlayınca, Floransa'daki Santa Maria Nuova Hastanesi'nde kadavralar üzerinde inceleme yapmasına izin verildi. Daha sonra Milano'daki Maggiore Hastanesi'nde ve Roma'daki Santo Spirito Hastanesi'nde de kadavralar üzerinde çalışmalar yaptı. 1510-1511 yıllarında doktor Marcantonio della Torre ile birlikte çalıştı. 30 yılda, farklı yaşlarda 30 adet kadın ve erkek kadavrası inceledi. Marcantonio ile birlikte anatomi konusunda teorik bir çalışma yayınlamak üzere çalışmalar yaptı ve 200'ün üzerinde çizim hazırladı. Bu çizimler ancak Leonardo'nun ölümünden sonra 1580'de "Resim Üzerine Tezler" adı altında yayınlandı.
Leonardo birçok insan iskeleti çizimi yaptı ve omurganın çift-s formunu ilk tanımlayan kişi oldu. Pelvis ve kuyruk sokumu hakkında incelemeler yaptı ve kuyruk sokumunun 5 farklı kemikten oluştuğunu belirledi. İnsan kafatasını ve beynin kesitlerini mükemmel şekilde tariflemeyi başardı. Ciğerlerin, idrar kesesinin, cinsel organların ve hatta cinsel birleşmenin yapısını gösteren çok sayıda çizim yaptı. "Hamilelik mucizesini anlamak amacıyla fetusun anne karnındaki pozisyonu hakkında çizimler yapan ilk birkaç kişiden biridir. İnsan anatomisine ek olarak, çeşitli hayvanların anatomisi hakkında da çizimleri bulunmaktadır.
Leonardo sadece insan vücudunun yapısıyla değil, aynı zamanda fonksiyonuyla da ilgileniyordu, bu yüzden anatominin yanısıra fizyoloji konusunda da çalışmalar yaptı. Fizyolojik deformasyonu olan kişilerle ilgili de çizimleri bulunmaktadır.
Anatomi alanındaki çalışmaları, yazılı tarihteki ilk robot tasarımınına öncülük etti. "Leonardo'nun robotu" adı verilen tasarım büyük olasılıkla 1495 yılında yapıldı ama ancak 1950'lerde farkedildi. Kan dolaşımı hakkında bilgisi olmamasına rağmen, robota eklediği kalp vanaları sayesinde kanın tüketilmek üzere kaslara pompalanmasını sağladı. Yaptığı bir çizim, 2005 yılında bir İngiliz kalp cerrahına hasar görmüş kalpleri tedavi etmek yolunda yepyeni bir yol keşfetmesi için ilham verdi.
